Floresan Mikroskobu Nasıl Çalışır? Floresan Mikroskobu Ne İşe Yarar?

FLORESAN MİKROSKOBU NEDİR?

Bir floresan mikroskobu, organik veya inorganik maddelerin saçılma, yansıma ve zayıflama veya absorpsiyon özelliklerini incelemek floresan yansımaları kullanan bir optik mikroskoptur.

Floresan mikroskobu terimi, ister epifloresan mikroskobu gibi basit bir kuruluma, isterse floresan görüntüsünün daha yüksek çözünürlüklü görüntüsünü elde etmek için optik kesiti kullanan konfokal mikroskop gibi daha karmaşık bir tasarıma sahip olsun, bir görüntü oluşturmak için floresan kullanan herhangi bir mikroskobu ifade eder.

FLORESAN MİKROSKOBU NASIL ÇALIŞIR? FLORESAN MİKROSKOBUNUN ÇALIŞMA PRENSİBİ NEDİR?

Floresan mikroskobu ile incelenecek numune, floroforlar tarafından emilen ve bu sayede daha uzun dalga boylarında yani, emilen ışıktan farklı bir renkte ışık yaymalarına neden olan belirli bir dalga boyuna sahip ışıkla aydınlatılır. Aydınlatma ışığı, bir spektral emisyon filtresi kullanılarak kendisinden çok daha zayıf yayılan floresandan ayrılır. Bir floresan mikroskobunun tipik bileşenleri ksenon ark lambası veya cıva buharlı lamba, daha gelişmiş formlar olan yüksek güçlü LED'ler ve lazerler gibi bir ışık kaynağı, uyarma filtresi, dikroik ayna veya dikroik ışın ayırıcı ve emisyon filtresidir. Filtreler ve dikroik ışın ayırıcı floroforun spektral uyarım ve emisyon özelliklerine uyacak şekilde seçilir. Bu şekilde, bir seferde tek bir floroforun (renk) dağılımı görüntülenir. Birkaç tür floroforun çok renkli görüntüleri, birkaç tek renkli görüntünün birleştirilmesiyle oluşturulur.

Örneğin aşağıdaki görsel bölünen bir kanser hücresinin DNA, Protein, mikrotübüller gibi bileşenlerini birbirinden kolaylıkla ayırt ederek görüntülemek için floresan mikroskobu kullanılarak elde edilmiş bir görüntüdür. Mavi renk ile boyanmış bölümler DNA, yeşille boyanmış bölümler INCENP isimli proteinler, ve kırmızı ile boyanmış bölümler ise mikrotübüllerdir.  Her bir florofor farklı filtreler kullanılarak görüntülenebildiğinden görüntü mavi, yeşil, kırmızı boyamalar için 3 ayrı seferde, 3 ayrı filtre ile görüntüleme yapılır. Ardından çeşitli görüntü analiz yazılımlarıyla elde edilen 3 görsel üst üste konulup hücrenin bütün hal görseli elde edilir.

 Kullanılan floresan mikroskopların çoğu, floroforun uyarılmasını ve floresansın tespitini aynı ışık yolu üzerinden yapan, biyolojide yaygın olarak kullanılan epifloresan mikroskoplardır.

EPİFLORESAN MİKROSKOPİSİ

Epifloresan mikroskopide floresan ışık numuneyi objektif lens aracılığıyla aydınlatır. Numune tarafından yayılan floresans yine bu objektif tarafından detektöre odaklanır. Uyarıcı ışığın çoğu numune üzerinden iletildiğinden, yalnızca yansıyan uyarıcı ışık, yayılan ışıkla birlikte hedefe ulaşır ve bu nedenle epifloresan yöntemi yüksek bir sinyal-gürültü oranı verir. Dikroik ışık ayırıcı, dalga boyuna özgü bir filtre görevi görür ve floresan ışığını göz merceğine veya dedektöre iletir mercekte görüntü oluşturur.

FLORESAN MİKROSKOPİSİNDE AYDINLATMA

Floresan mikroskopisi, halojen lambalar gibi bazı yaygın ışık kaynaklarının sağlayamadığı yoğun, neredeyse monokromatik bir aydınlatma sistemi gerektirir. Ksenon ark lambaları veya cıva buharlı lambalar, lazerler, süper sürekli kaynaklar ve yüksek güçlü LED'ler dahil olmak üzere dört ana ışık kaynağı türü kullanılır. Lazerler üst düzey ve karmaşık floresan mikroskopi teknikleri için kullanılırken, ksenon lambaları ve cıva lambaları ve dikroik uyarma filtreli LED'ler yaygın olarak geniş alan epifloresan mikroskoplarında kullanılır. Geniş alanlı bir epifloresan mikroskobunun aydınlatma yoluna iki mikrolens dizisi yerleştirerek, %1-2'lik bir varyasyon katsayısı ile yüksek düzeyde homojen aydınlatma elde edilebilir.

NUMUNE HAZIRLAMA

Bir numunenin floresan mikroskopi ile incelenebilmesi için floresan yapıda olması gerekir. Floresan numune oluşturmanın birkaç yöntemi vardır; ana teknikler, floresan boyalarla etiketleme veya biyolojik numuneler söz konusu olduğunda, bir floresan proteinin ekspresyonudur. Alternatif olarak, bir numunenin otofloresansı da kullanılabilir.

BİYOLOJİK FLORESAN BOYALAR

Birçok floresan boya, bir dizi biyolojik molekül için tasarlanmıştır. Bunlardan bazıları, özünde floresan olan ve ilgili biyolojik bir molekülü bağlayan küçük moleküllerdir. Bunların başlıca örnekleri, tümü DNA'nın yapısını oluşturan nükleik asitleri bağlayan bağlayan, böylece hücre çekirdeklerini etiketleyen DAPI, Hoechst, DRAQ5, DRAQ7 boyalarıdır. Diğerleri, spesifik hücresel yapılara bağlanan ve bir floresan raportör ile türevlendirilmiş ilaçlar, toksinler veya peptitlerdir. Bu floresan boya sınıfının önemli bir örneği, memeli hücrelerinde aktin liflerini boyamak için kullanılan phalloidindir. Bitki hücre duvarlarının boyanması, selüloz veya pektin bağlayan lekeler veya boyalar kullanılarak gerçekleştirilir.

Hedef bileşeni bağlayan farklı bir moleküle kimyasal olarak bağlanabilen floresan, Alexa Fluors veya DyLight 488 gibi floroforlar veya florokromlar olarak adlandırılan birçok floresan molekül vardır.

Floresan mikroskobu immünofloresan tekniğiyle bir antikorun antijenine yüksek düzeyde spesifik bağlanmasını kullanarak hücre içindeki spesifik proteinleri veya diğer molekülleri etiketleyebilir. DNA modifikasyonunda dahi kullanılır.

FLORESAN MİKROSKOBUNUN ÖZELLİKLERİ

İletilen ve yansıyan ışık mikroskobu tekniklerinden farklı olarak, flüoresans mikroskobu yalnızca flüoresans için etiketlenmiş belirli yapıların gözlemlenmesine izin verir. Örneğin, floresan mikroskobu ile floresan DNA boyası ile hazırlanmış bir doku örneğini gözlemlemek, sadece DNA'nın hücreler içindeki organizasyonunu ortaya çıkarır ve hücre morfolojileri hakkında başka hiçbir şey ortaya çıkarmaz. Floresan olmayan görüntülerden (parlak alan gibi) floresan sinyali tahmin etmeyi sağlayan tekniklerle incelenmekte olan hücreler ayrıştırılarak fototoksisite azaltılmaktadır.

Floroforlar aydınlatıldıkça elektronlarda kimyasal hasar birikimi olur ve floresan özelliklerini kaybeder, fototoksik etkiyi artıran reaktif kimyasal türler üretirler. Bu süreç fotoağartma olarak adlandırılır. Fotoağartma, bir örneğin floresan mikroskobu ile gözlemlenebileceği süreyi ciddi şekilde sınırlayabilir.

Fotoağartmayı azaltmak için, aydınlatmayı en aza indirerek veya fotokoruyucu temizleyici kimyasallar kullanarak daha sağlam floroforların kullanımı gibi çeşitli teknikler geliştirilmiştir.

FLORESAN MİKROSKOP FİYATLARI